单细胞分析揭示了胃印戒细胞癌的细胞学和免疫微环境特征 | 单细胞专题

期刊名称：nature communications

发表时间：2023

所用组学：单细胞转录组测序（ScRNA seq）

一、研究背景

胃印戒细胞癌（GSRC）是胃癌（GC）的一种特殊亚型，与预后不良相关，但目前对GSRC尚缺乏深入和系统的研究。作者进行了单细胞RNA测序来评估GC样本，鉴定了印戒细胞癌（SRCC）细胞。微精原蛋白（MSMB）可作为一种标记基因，指导中/低分化腺癌和印戒细胞癌（SRCC）的鉴定。SRCC细胞中表达上调的差异表达基因主要富集在异常激活的癌症相关信号通路和免疫应答信号通路中。SRCC细胞也显著富集于丝裂原活化蛋白激酶和雌激素信号通路，它们可以在一个正反馈回路中相互作用和促进。SRCC细胞具有较低的细胞粘附能力和较高的免疫逃避能力，以及免疫抑制微环境，这可能与GSRC相对较差的预后密切相关。综上所述，GSRC具有独特的细胞学特征和独特的免疫微环境。

二、实验设计

• 单细胞转录组测序：13名接受胃根治性切除术的GA患者与其中五位患者的癌旁组织

图1 实验设计

三、研究结果

1、cSCC的多模态分析

首先， scRNA-seq无监督聚类识别GA鉴定出26种主要细胞类型（图1c）。利用Seurat软件分析细胞簇间的基因表达差异，并筛选在不同细胞中表达上调的基因（图1d）。对细胞类型进行识别最终确定了8个不同细胞簇包括有B细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞、肌样细胞、平滑肌细胞以及T细胞（图1e），为了进一步了解各种类型细胞的聚类情况，从细胞来源、分组和细胞比例等方面进行了深入的分析（图1f-h）。

图1：scRNA-seq概述和鉴定癌旁组织和GA组织中的主要细胞类型

Tips：上图可通过联川星云绘制

2、恶性和非恶性上皮细胞的鉴定

在将上皮细胞重新聚类后（图2a），根据标记基因重新划分成5个亚群，包括有癌细胞、主细胞、内分泌细胞、粘液细胞和壁细胞（图2b-d）。低分化腺癌伴印戒细胞癌（PDSRCC）和GSRC中粘液细胞的比例明显增加根据上述结果（图2e），对粘液细胞标记物进行了免疫荧光分析，发现这些标记物也在SRCC细胞中进行表达（图2f）。

图2：上皮细胞的单细胞转录组图谱

同时SRCC细胞中含有大量的粘液细胞为了区分黏液细胞的来源将独立来自于肿瘤组织的细胞归为SRCC细胞，其余定义为粘液细胞（图2g-h）。

图2：上皮细胞的单细胞转录组图谱

Tips：上图可通过联川星云绘制

为了验证聚类的准确性，将主细胞、壁细胞和内皮细胞归类为非恶性上皮细胞与M/PDA细胞进行癌症相关基因表达水平的比较，结果显示两组间有显著性差异（图3a），在SRCC和粘液细胞中也出现同样结果（图3b）。其次，M/PDA细胞的CNV显著高于非恶性上皮细胞和粘液细胞，而SRCC细胞的CNV显著低于粘液细胞（图3c）。此外，为基于InferCNV计算了所有亚群的CNV评分。亚群6、11、12和13的CNV评分相对较高；因此，这些亚群被鉴定为具有恶性肿瘤典型特征的M/PDA细胞（图3d）。SRCC细胞的CNV评分低于M/PDA和粘液细胞，但高于非恶性上皮细胞（图3e）。根据GSVA的结果，M/PDA细胞主要富集于与肿瘤相关的信号通路中，促进肿瘤的生长、增殖和转移。GSVA也被用来鉴定其他相关信号通路，对癌症研究至关重要（图3f）。

图3：非恶性上皮和恶性上皮经鉴定后的验证图

3、单细胞转录组揭示了SRCC的特征

SRCC细胞被分为4个亚群（图4a）。热图分析显示，SRCC细胞间存在显著的异质性（图4b），在这四个亚群中，发现了一些常见的高表达基因，如CLDN18、PHLDA2、ATF3、HBEGF、SYTL2、PGC和LYZ，这些基因可能也参与了GSRC的发展过程。此外，SRCC细胞在与细胞增殖相关的信号通路中富集，包括G2/M检查点、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和TP63靶点信号通路MSMB被发现是GSRC的一个潜在的标记基因（图4c）。MSMB的表达水平与在SRCC细胞亚群中的表达水平基本一致，并且MSMB在M/PDA细胞中基本没有/低表达（图4d，e）。SRCC细胞中MSMB的表达水平高于黏液细胞和M/PDA细胞最后结果验证证实SRCC细胞中MSMB的表达水平高于M/PDA细胞（图4f），但低于癌旁组织的胃中央凹增殖区（图4I）。

图4：SRCC细胞的基本特征

4、基M/PDA和SRCC细胞的异同

临床上，M/PDA和GSRC在生物学行为上存在显著差异，这些差异主要表现在肿瘤实质。为了了解这些差异，我们分析了M/PDA和SRCC细胞中的DEGs（图5a），通过对上调的DEGs和信号通路的富集分析，发现PDA/PDA细胞中，SRCC细胞中上调的基因主要富集异常活跃的癌症相关信号通路（如癌症中的转录失调、癌症通路和癌症中的microrna）和与免疫逃逸的信号通路（如TNF-α信号通路、TGF-β信号通路和NF-kB信号通路）密切相关（图5b，c）。在细胞培养中进行了相应的验证结果相同获得（图5d、e）。M/PDA细胞具有较高的增殖能力和免疫监视能力，而SRCC细胞具有较低的细胞粘附能力。

图5：M/PDA和SRCC细胞的异同

Tips：上图可通过联川星云绘制

5、M/PDA和GSRC中B细胞的浸润特性

利用标记基因（图6a），将簇3和簇4中的B细胞重新聚类为16个亚群（图6b），主要定义为MALT-B细胞、滤泡B细胞、记忆B细胞以及浆细胞，其中MALT-B细胞主要表达iga相关基因，而浆细胞主要表达igg相关基因（图6c），MALT-B和浆细胞具有相似的功能，主要与免疫应答、b细胞激活和参与补体激活有关。然而，滤泡B细胞的免疫反应相对较弱（图6d）。与M/PDA相比，GSRC中肿瘤浸润的滤泡B细胞较高，而MALT-B细胞无明显差异（图6e），与M/PDA相比，GSRC中肿瘤浸润性滤泡B细胞和MALT-B的IHC评分均较高(图6f)。综上所述，与M/PDA相比，B细胞亚簇在GSRC中表现出独特的浸润特征，主要是滤泡性B细胞。此外，滤泡B细胞的免疫反应相对较弱；这也可能是GSRC预后不良的原因之一。

图6：M/ PDA与GSRC之间肿瘤浸润性B细胞的异同

Tips：上图可通过联川星云绘制

6、M/PDA和GSRC中T细胞的浸润特性

来自0、1、13和14个簇的T细胞被重新聚集成14个独立的亚群（图7a）。使用标记基因将这些亚群重新细分，归类，包括有CD4-Th17、CD4-Tn、CD8-Teff、CD8-Tex、CD4-Treg、Naive T、CD8- Tem、Pro T、自然杀伤（NK）细胞以及其他细胞（图7c)。对照组织样本发现CD4-Th17、CD4-Tn或Tcm和CD8-Teff细胞主要浸润癌旁组织，肿瘤组织中CD4-Treg细胞在GSRC中的浸润率明显高于癌旁组织，尤其是GSRC组织。同时，GSRC的肿瘤浸润性CD8-Teff细胞少于M/PDA肿瘤浸润CD8- Teff细胞在GSRC中的比例较低综上所述（图7d-e），GSRC中的T细胞亚群表现出独特的浸润特征，CD4-Treg细胞浸润增加，CD8-Teff细胞浸润减少，主要表现为免疫抑制微环境。

 图7：M/ PDA与GSRC之间肿瘤浸润性T细胞的异同

Tips：上图可通过联川星云绘制

四、研究亮点

• 全面解析了GSRC特异的转录信号变化和高免疫抑制肿瘤免疫微环境

• 揭示了GSRC的潜在生物标志物MSMB，其与GSRC的分化及发育密切相关，可用于指导印戒细胞癌的鉴定

• 阐明了GSRC具有较低的细胞粘附和较高的免疫逃避能力，可能与其预后相对较差密切相关

• 与胃中/低分化腺癌相比较相比，GSRC细胞具有独特的细胞学特征和独特的免疫微环境，可能有利于GSRC的准确诊断和治疗。

关于联川

杭州联川生物为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。单细胞测序作为联川战略发展方向，在组织解离和单细胞生信分析方面充分发挥自身优势，为客户提供优质的服务。目前已经与100多个国家及地区的科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞测序相关的SCI论文近百篇，影响因子平均15+。

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